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superior à dose constante de antibiótico usada na terapia e atingida no plasma
do paciente.
Entre as Enterobacteriaceae, a principal BE pertence à família RND, na qual a
energia necessária ao efluxo provém da força proto-motriz (PMF). Factores do
meio envolvente, tais como, cálcio, pH ou glucose (fonte de energia), têm
extrema influência nos mecanismos de retenção ou efluxo de compostos pela
célula. Contudo, uma vez que o invólucro celular é o primeiro componente
bacteriano a enfrentar alterações das condições do meio onde a bactéria se
encontra, tais como alteração da pressão hidrostática, osmolaridade ou
pressão antibiótica, é essencial compreender a generalidade dos processos
envolvidos na aquisição de resistência. Assim, é urgente compreender como é
que as condições do meio influenciam a composição da membrana celular e os
seus mecanismos de efluxo.
A primeira parte desta dissertação estuda o efeito dessas condições na
composição da membrana externa e nas respostas celulares. Foi então
estudado o efeito do
stress
provocado quer por aumentos crescentes na
concentração de antibiótico, quer por passagens sucessivas da estirpe
bacteriana em concentrações constantes de antibiótico, simulando o que
acontece no paciente quando submetido a longos períodos de terapia com
antibiótico.
Moduladores do efluxo podem ser usados em terapia, conjuntamente com os
antibióticos, de modo a aumentar o seu efeito terapêutico. A sua utilização
começa a ser aceite como uma nova abordagem terapêutica contra a multi-
resistência. Deste modo a segunda parte desta tese foca a purificação e
caracterização de compostos isolados da planta
Carpobrotus edulis
, cujo
extracto metanólico mostrou, anteriormente, inibir BE bacterianas. Uma vez
que foi já demonstrado existir uma relação entre BE de bactérias e de células
cancerígenas, foi também estudado o efeito inibitório dos compostos
purificados num dos transportadores com mais relevância em multi-resistência
em células cancerígenas (P-gp).
Métodos:
Foram utilizados métodos de extracção de proteínas e electroforese
para estudar a composição da membrana externa de células bacterianas cujo
crescimento ocorreu em dois meios diferentes: sólido e líquido. O efeito da
pressão antibiótica na expressão de BEs foi estudada através do crescimento
de estirpes bacterianas em concentrações crescentes de antibiótico ou
mantendo-as em concentrações de antibiótico constantes por longos períodos
de tempo. No final das sucessivas passagens foi estudada a resposta celular a
diferentes antibióticos na presença de moduladores de efluxo bem como os
níveis de expressão de BEs por RT-PCR em tempo real. O efeito de
moduladores de efluxo tais como CCCP, PAβN, verapamil ou fenotiazinas e os
efeitos do cálcio, pH e fontes de energia foram estudados pelo método semi-
automático que segue a acumulação ou efluxo de brometo de etidium pelas
células bacterianas, em tempo real, nas condições aplicadas ao meio do ensaio
experimental.
O estudo das actividades
in vitro
dos compostos isolados de
C. edulis
em
relação a estirpes de referência e outras multi-resistentes, que sobre-
expressam determinadas BE, foi realizado por determinação das
concentrações mínimas inibitórias dos compostos, bem como de outros
antibióticos, aos quais as estirpes eram resistentes, na presença do composto.
O método semi-automático atrás referido foi também utilizado no estudo destes
compostos como moduladores de efluxo. A influência destes compostos na
morte de estirpes bacterianas fagocitadas por macrófagos foi também
estudada: ensaios
ex vivo
. Por fim, foi estudada a actividade antiproliferativa