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superior à dose constante de antibiótico usada na terapia e atingida no plasma

do paciente.

Entre as Enterobacteriaceae, a principal BE pertence à família RND, na qual a

energia necessária ao efluxo provém da força proto-motriz (PMF). Factores do

meio envolvente, tais como, cálcio, pH ou glucose (fonte de energia), têm

extrema influência nos mecanismos de retenção ou efluxo de compostos pela

célula. Contudo, uma vez que o invólucro celular é o primeiro componente

bacteriano a enfrentar alterações das condições do meio onde a bactéria se

encontra, tais como alteração da pressão hidrostática, osmolaridade ou

pressão antibiótica, é essencial compreender a generalidade dos processos

envolvidos na aquisição de resistência. Assim, é urgente compreender como é

que as condições do meio influenciam a composição da membrana celular e os

seus mecanismos de efluxo.

A primeira parte desta dissertação estuda o efeito dessas condições na

composição da membrana externa e nas respostas celulares. Foi então

estudado o efeito do

stress

provocado quer por aumentos crescentes na

concentração de antibiótico, quer por passagens sucessivas da estirpe

bacteriana em concentrações constantes de antibiótico, simulando o que

acontece no paciente quando submetido a longos períodos de terapia com

antibiótico.

Moduladores do efluxo podem ser usados em terapia, conjuntamente com os

antibióticos, de modo a aumentar o seu efeito terapêutico. A sua utilização

começa a ser aceite como uma nova abordagem terapêutica contra a multi-

resistência. Deste modo a segunda parte desta tese foca a purificação e

caracterização de compostos isolados da planta

Carpobrotus edulis

, cujo

extracto metanólico mostrou, anteriormente, inibir BE bacterianas. Uma vez

que foi já demonstrado existir uma relação entre BE de bactérias e de células

cancerígenas, foi também estudado o efeito inibitório dos compostos

purificados num dos transportadores com mais relevância em multi-resistência

em células cancerígenas (P-gp).

Métodos:

Foram utilizados métodos de extracção de proteínas e electroforese

para estudar a composição da membrana externa de células bacterianas cujo

crescimento ocorreu em dois meios diferentes: sólido e líquido. O efeito da

pressão antibiótica na expressão de BEs foi estudada através do crescimento

de estirpes bacterianas em concentrações crescentes de antibiótico ou

mantendo-as em concentrações de antibiótico constantes por longos períodos

de tempo. No final das sucessivas passagens foi estudada a resposta celular a

diferentes antibióticos na presença de moduladores de efluxo bem como os

níveis de expressão de BEs por RT-PCR em tempo real. O efeito de

moduladores de efluxo tais como CCCP, PAβN, verapamil ou fenotiazinas e os

efeitos do cálcio, pH e fontes de energia foram estudados pelo método semi-

automático que segue a acumulação ou efluxo de brometo de etidium pelas

células bacterianas, em tempo real, nas condições aplicadas ao meio do ensaio

experimental.

O estudo das actividades

in vitro

dos compostos isolados de

C. edulis

em

relação a estirpes de referência e outras multi-resistentes, que sobre-

expressam determinadas BE, foi realizado por determinação das

concentrações mínimas inibitórias dos compostos, bem como de outros

antibióticos, aos quais as estirpes eram resistentes, na presença do composto.

O método semi-automático atrás referido foi também utilizado no estudo destes

compostos como moduladores de efluxo. A influência destes compostos na

morte de estirpes bacterianas fagocitadas por macrófagos foi também

estudada: ensaios

ex vivo

. Por fim, foi estudada a actividade antiproliferativa