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substrato de bombas de efluxo e desta forma consistir uma forma de aumentar
a actividade dos actuais fármacos utilizados no tratamento da TB.
O trabalho descrito nesta dissertação tem como objectivo o estudo dos
mecanismos de efluxo no desenvolvimento de multirresistência em
M.
tuberculosis
e de como a resistência fenotípica mediada por bombas de efluxo
se correlaciona com a resistência genética. De forma a alcançar este objectivo,
foram desenvolvidos vários protocolos experimentais utilizando modelos
biológicos, tais como
Escherichia coli
,
Mycobacterium smegmatis
uma micobactéria de crescimento rápido e
Mycobacterium avium
, antes da sua aplicação ao estudo de
M. tuberculosis
.
Esta abordagem permitiu o estudo dos mecanismos que resultam na
adaptação fisiológica de
E. coli
à tetraciclina por exposição a concentrações
subinibitórias deste antibiótico (Capítulo II), o desenvolvimento de um método
fluorimétrico que permite a detecção e quantificação da actividade de efluxo
(Capítulo III), a caracterização do transporte de brometo de etídeo em
M.
smegmatis
(Capítulo IV) e a contribuição da actividade de efluxo para a
resistência aos macrólidos no complexo
Mycobacterium avium
(Capítulo V).
Por fim, os métodos desenvolvidos permitiram o estudo do papel das bombas
de efluxo em estirpes de
M. tuberculosis
induzidas a resistência à isoniazida.
Assim, como descrito no Capítulo II, foi possível observar que a adaptação
fisiológica de
E. coli
à presença de tetraciclina resulta de uma interacção entre
mecanismos a nível genético e modificações pós-traducionais a nível da
conformação de proteínas que diminui a permeabilidade da parede celular e
aumenta a actividade das bombas de efluxo. Para além disso, o Capítulo III
descreve o desenvolvimento de um método fluorimétrico semi-automático que
permitiu correlacionar esta actividade de fluxo com a cinética de transporte do
brometo de etídeo (um conhecido substrato de bombas de efluxo) em
E. coli
e
também a identificação de inibidores do efluxo.
Relativamente a
M. smegmatis
, comparou-se a estirpe selvagem
M. smegmatis
mc2155 com mutantes "knockout" para LfrA e MspA, no que respeita à sua
capacidade de transportar brometo de etídeo. Os resultados apresentados no
Capítulo IV demonstraram que MspA, a principal porina de
M. smegmatis
,
desempenha um papel importante na entrada de brometo de etídeo e
antibióticos na célula e que o efluxo através da bomba LfrA está envolvido na
resistência de baixo nível a estes compostos em
M. smegmatis
. O Capítulo V
descreve o estudo da contribuição de bombas de efluxo na resistência aos
macrólidos em estirpes clínicas do complexo
M. avium
. Demonstrou-se que a
resistência à claritromicina sofreu uma redução significativa na presença dos
inibidores de efluxo tioridazina, clorpromazina e verapamil. Estes inibidores
também diminuíram o efluxo de brometo de etideo e aumentaram a retenção
de eritromicina marcada com 14C nestas estirpes.
Por fim, os métodos desenvolvidos com os modelos experimentais referidos
acima permitiram o estudo do papel das bombas de efluxo em estirpes de
M.
tuberculosis
induzidas à resistência à isoniazida. Este trabalho encontra-se
descrito no Capítulo VI desta dissertação, onde se demonstra que a indução de
resistência à isoniazida não resultou da ocorrência de mutações em qualquer
um dos genes associados com a resistência a este fármaco, mas de um
sistema de efluxo que é sensível a inibidores do efluxo. Estes inibidores
provocaram a diminuição do efluxo de brometo de etídeo e também a redução
da concentração mínima inibitória da isoniazida nestas estirpes.
Para além disso, a análise de expressão genética demonstrou a sobre-
expressão de genes que codificam para bombas de efluxo nas estirpes
induzidas comparativamente com as estirpes originais não induzidas.