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alvos de fármacos, e encontram-se em validação inibidores específicos para a
quimioterapia da leishmaniose, da malária e da tripanossomíase. Neste estudo,
o nosso principal interesse na identificação e caracterização de proteases
como alvos de fármacos foi portanto nesta classe de proteases.
Foram identificados no banco de dados do projecto em curso de sequenciação
do genoma de
B. bigemina
, os genes putativos de proteases cisteínicas em
pesquisas por similaridade de sequência, que posteriormente foram
comparados com os genes anotados nos genomas completos das espécies de
piroplasmas bovinos
B. bovis
,
Theileria annulata
e
T. parva
. Para avaliar os
eventos da evolução molecular que ocorreram na família C1 de proteases
cisteínicas, foram feitos alinhamentos múltiplos entre os genomas e análises
das sequências obtidas destes piroplasmas de importância veterinária. Existem
assim, cinco grupos distintos de genes de proteases cisteínicas da família C1
em
B. bigemina
(5 genes), quatro grupos em
B. bovis
(4 genes) e seis grupos
em
Theileria
spp. (13 genes). No Género
Theileria
a evolução molecular
ocorreu através da duplicação de genes e da diversificação da sequência das
proteínas codificadas por estes genes. Estas importantes diferenças
observadas entre os Géneros
Babesia
e
Theileria
na família das proteases
cisteínicas, podem parcialmente explicar os diferentes mecanismos de infecção
destas espécies, em que parasitas
Babesia
não invadem linfócitos e parasitas
Theileria
invadem primeiro os linfócitos no hospedeiro vertebrado.
A babesipaína-1, uma das proteases cisteínicas identificadas no genoma de
B.
bigemina
, foi expressa como uma proteína de fusão com a glutationa S-
transferase (GST) e a respectiva fracção solúvel foi purificada por
cromatografia de afinidade. A babesipaína-1 recombinante apresentou
actividade contra certos péptidos que são substratos típicos de proteases
cisteínicas, e foi inibida por um inibidor geral da sua classe, mas o baixo
rendimento da purificação da fracção solúvel impediu a sua caracterização
adicional.
A babesipaína-1 foi então purificada a partir da fracção insolúvel, e a proteína
desnaturada foi re-enrolada e activada para produzir uma enzima activa. A
análise da actividade da babesipaína-1 revelou propriedades típicas de uma
protease cisteínica da família da papaína, incluindo a hidrólise de alguns
péptidos que são substratos típicos da família da papaína, um pH ácido óptimo
(5.5-6.0), o requisito de um ambiente redutor para ter actividade máxima, e a
inibição por inibidores de proteases cisteínicas como o E-64, a leupeptina, o
ALLN e a cistatina. Os resultados sugerem que a babesipaína-1 tem um papel
no citosol, já que a babesipaína-1 manteve elevada actividade contra
substratos a pH 7,5 (83% do máximo), uma característica incomum das
proteases cisteínicas de parasitas protozoários.
Assim, os resultados deste estudo demonstram que a babesiose bovina é uma
infecção comum na província de Maputo em Moçambique, embora a doença
não esteja numa situação de estabilidade endémica. Os resultados também
sugerem que as proteases cisteínicas de
Babesia
spp. são alvos promissores
para fármacos e consequentemente para o desenvolvimento de um tratamento
eficaz para a babesiose bovina. Na sequência destes resultados foi associado
um plano de trabalho futuro. Alguns pormenores e resultados deste trabalho
podem ser transferidos para outros países, inclusivamente Portugal.