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sinais de localização nuclear pelas proteínas celulares especializadas no
transporte nuclear através do poro nuclear.
O presente trabalho teve como objectivo identificar os sinais presentes no RNA
do HDV e nos HDAgs, e as proteínas celulares envolvidas no transporte
núcleo-citoplasmático das RNPs do vírus. Com o objectivo de identificar os
elementos de exportação nuclear presentes no RNA do HDV procedeu-se à
construção e expressão de uma série de mutantes de deleção de um
plasmídeo (pDL542) que codifica exclusivamente para o RNA genómico do
vírus. Para a construção dos mutantes de deleção utilizou-se uma abordagem
que se baseia na utilização da exonuclease III (Exo III). Os cDNAs do HDV com
dimensões progressivamente menores, resultantes da digestão com a Exo III,
foram clonados e utilizados para transfectar células Huh7. A identificação dos
RNAs defectivos na exportação nuclear foi efectuada por comparação do
padrão de distribuição intracelular de cada mutante de deleção com a
localização do RNA genómico do HDV do tipo selvagem, através de
experiências de hibridação
in situ
.
A presença de sinais de exportação nuclear no RNA do HDV foi também
estudada por quantificação dos níveis de expressão da proteína CAT em
extractos de células transfectadas com o vector repórter pDM138, no qual
foram inseridos vários fragmentos de cDNA que codificam para diferentes
partes do RNA genómico e antigenómico do vírus. Como resultado da
transcrição do vector repórter pDM138 são produzidos mRNAs que possuem a
ORF da proteína CAT inserida numa região intrónica do genoma do HIV-1. A
exportação e acumulação citoplasmática destes mRNAs depende da presença
de sequências funcionais na exportação e está correlacionada com o aumento
dos níveis da expressão da proteína CAT. Deste modo, a presença de um sinal
de exportação numa sequência de RNA pode ser facilmente investigada por
quantificação da proteína repórter CAT.
O estudo da distribuição intracelular dos RNAs produzidos a partir dos
mutantes de deleção do plasmídeo pDL542 não permitiu identificar nenhuma
sequência no RNA genómico do vírus essencial para a exportação nuclear,
uma vez que todos os mutantes de deleção do RNA genómico do HDV
apresentam o mesmo padrão de distribuição intracelular do RNA genómico do
tipo selvagem. No entanto, registou-se uma redução significativa no número de
células transfectadas em que o RNA viral foi detectado no citoplasma, quando
se analisaram as formas truncadas do RNA genómico sem as sequências
compreendidas entre os nucleótidos 1211 e 1487, e 476 e 512.
Os resultados dos ensaios de quantificação da expressão da proteína CAT
após transfecção de células Huh7 com os vectores pDM138 que codificam para
diferentes partes do RNA genómico do HDV mostraram a presença de três
sequências no genoma do vírus capazes de causar um aumento na expressão
da proteína CAT superior ao observado em células transfectadas com o vector
pDM138 parental. Duas das sequências analisadas (nt 1191-1414 e 415-613)
sobrepõem-se parcialmente com as regiões identificadas no genoma do HDV,
na ausência das quais se observa uma redução significativa na percentagem
de células com marcação citoplasmática. Em conjunto, estes resultados
poderão indicar que o RNA genómico possui mais do que um elemento
cis
envolvido na exportação nuclear e que a eficiência do transporte do núcleo
para o citoplasma está relacionada com o número de sinais de exportação
presentes no genoma do vírus.
A aplicação da mesma abordagem experimental para a pesquisa de sinais de
exportação no antigenoma do HDV mostrou que este RNA viral possui um
elemento
cis,
situado entre os nt 1263 a 1466, funcionalmente equivalente ao