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PRE do HBV. A actividade do sinal de exportação do antigenoma do HDV
parece depender, da orientação da sequência identificada em relação à ORF
da proteína CAT e da exportina CRM1. Demonstrou-se ainda, que o aumento
da expressão da proteína repórter, induzido pela sequência compreendida
entre os nt 1263 e 1466 do RNA antigenómico do HDV, resulta da exportação e
acumulação citoplasmática de mRNAs repórter contendo a ORF da proteína
CAT inserida no intrão.
Estes ensaios foram conduzidos na ausência de replicação viral e consequente
acumulação dos HDAg, sugerindo que os antigénios delta não são necessários
para o transporte do RNA antigenómico do HDV do núcleo para o citoplasma. A
análise funcional do elemento de exportação no transporte do RNA
antigenómico para o citoplasma foi efectuada por comparação da distribuição
intracelular do antigenoma do HDV com e sem o sinal de exportação nuclear. A
redução de 60% na proporção de RNA no citoplasma em relação à quantidade
de RNA antigenómico nas fracções nucleares, avaliada por qRT-PCR, mostra
que o sinal de exportação situado entre os nt 1263 e 1466 altera a distribuição
do antigenoma do HDV. Adicionalmente, utilizando uma abordagem similar
demonstrou-se que os RNAs genómicos e antigenómicos do HDV, na ausência
de replicação do vírus, são exportados em quantidades semelhantes.
A abordagem utilizada para a identificação das sequências de aminoácidos do
HDAg necessárias para a importação nuclear consistiu na expressão de
diferentes subregiões do cDNA do HDAg clonadas na mesma grelha de leitura
do gene da proteína repórter
c-myc
-PK que, na ausência de NLS funcionais, se
acumula exclusivamente no citoplasma das células.
Após análise detalhada dos aminoácidos do HDAg necessários e suficientes
para promover a importação nuclear da proteína
c-myc
-PK confirmou-se a
importância do NLS identificado na localização intracelular do HDAg nativo.
Neste trabalho, obtiveram-se evidências sólidas que a importação nuclear do
HDAg é dirigida por um único NLS, constituído por uma sequência contínua de
10 aminoácidos (EGAPPAKRAR), que se situam nas posições 66 a 75 na
proteína. Esta sequência corresponde ao primeiro domínio do NLS bipartido
anteriormente identificado no HDAg como sendo essencial para a importação
nuclear de uma proteína repórter, diferindo apenas pela presença de um
resíduo de ácido glutâmico adicional. Foi ainda demonstrado, que o NLS do
HDAg não é específico para células hepáticas. As experiências de
cromatografia de afinidade e de espectrometria de massa realizadas com o
objectivo de identificar as proteínas celulares que interagem especificamente
com o NLS do HDAg não permitiram elucidar o mecanismo pelo qual o
antigénio delta é importado para o núcleo. Contudo, a identificação de
proteínas de ligação a elementos do citoesqueleto poderá indicar o
envolvimento desta estrutura no mecanismo de importação nuclear dos HDAg
e das RNPs do HDV.
MARTINS, Tiago Lopes (2009) Identification of proteases as
diagnostic and targets in bovine babesiosis, Dissertação de
Doutoramento no ramo de Ciências Biomédicas, especialidade de
Parasitologia. IHMT. Lisboa.
A babesiose bovina é uma doença transmitida por carraças, que causa elevada
morbidade e mortalidade, e provoca consideráveis perdas económicas devido
aos esforços para controlar esta doença. As medidas de controlo da babesiose