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estratégia global de otimização sistemática, alicerçada num modelo educativo
que incentive a maximização das competências individuais e da equipa e
estimule o papel dos cidadãos, saudáveis e doentes, como co-produtores da
saúde.
ALVES, Carolina Alpalhão Mantero de Mendonça
(2013)–
Characterization of the-hepatitis delta virus small antigen:
intracellular localization, structure, multimerization and RNA
binding A bility. Dissertação de Doutoramento no ramo de
Ciências Biomédicas, especialidade de Biologia Molecular e
Celular. IHMT. Lisboa.
Resumo: O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente patogénico responsável
por uma das formas mais severas de hepatite viral. O genoma consiste numa
molécula circular de RNA de cadeia simples de polaridade negativa e
apresenta uma única proteína viral, o antigénio delta pequeno (S-HDAg). Na
sequência de um mecanismo de
editing
outra proteína viral é traduzida, o
antigénio delta grande (L-HDAg). Apesar de partilharem grande parte da sua
sequência, as duas proteínas desempenham funções distintas. O S-HDAg é
essencial para a acumulação de RNAs virais enquanto o L-HDAg inibe a
replicação viral e é necessário para o empacotamento. O HDV depende
extensivamente de factores do hospedeiro para completar o seu ciclo de
replicação. Pensa-se que a polymerase II (pol II) do hospedeiro é
redireccionada para transcrever o RNA viral.
No presente trabalho procurou-se caracterizar o S-HDAg e clarificar o seu
papel no ciclo de replicação do HDV.
Observamos que quando o S-HDAg é expresso na presença de replicação do
RNA viral, o antigénio co-localiza com a pol II. Contudo, a co-localização com
pol II verifica-se mesmo na presença de RNA viral incapaz de ser replicado e
na ocorrência de inibição da replicação viral, sugerindo que o S-HDAg não
participa directamente na transcrição do RNA viral. Assim, propomos que o S-
HDAg é essencial para acumulação de RNAs virais protegendo ou
estabilizando os RNAs. Observamos ainda que na ausência de RNA viral o S-
HDAg co-localiza com a nucleolina nos nucléolos. Contudo, na presença de
RNA incapaz de ser replicado, o antigénio desloca-se para o nucleoplasma
mantendo-se a nucleolina nos nucléolos, sugerindo que o S-HDAg não interage
directamente com a nucleolina.
Ao estudarmos as características estruturais do S-HDAg verificámos, utilizando
um preditor de desordem intrínseca, que apresenta um elevado grau de
desordem. A previsão foi confirmada
in vitro
por dicroísmo circular observando-
se que apenas 30% dos amino ácidos adoptam uma conformação de hélice .
A ausência de uma estrutura rígida pode conferir ao antigénio flexibilidade para
se adaptar a diferentes parceiros e participar em vários passos do ciclo de
replicação viral.
A multimerização do S-HDAg foi analisada por dispersão de luz dinâmica. Os
resultados indicam que o antigénio recombinante purificado é capaz de formar
multímeros de 12 moléculas. Adicionalmente, foram observados multímeros de
seis a oito moléculas em gel de poliacrilamida desnaturante, após
cross-linking
.