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MACHADO, Diana Isabel Oliveira (2014) The dynamics of drug
resistance in Mycobacterium Tuberculosis: exploring the
biological basis of multi – and extensively drug resistant
tubercfulosis (MDR/XDRTB) as a route for alternative therapeutic
strategies. Dissertação de Doutoramento no ramo de Ciências
Biomédicas, especialidade de Microbiologia. IHMT. Lisboa.
Resumo: Estirpes de
Mycobacterium tuberculosis
multi- e extensivamente
resistentes, constituem uma ameaça para a saúde humana. O principal
objectivo desta Tese foi estudar os fenómenos subjacentes ao
desenvolvimento da resistência em
M. tuberculosis
, de modo a ser possível
desenvolver estratégias para reduzir o seu desenvolvimento.
Iniciamos o estudo com a descrição da base molecular da resistência aos
antibacilares em estirpes clinicas de
M. tuberculosis
circulantes em Lisboa,
através da determinação dos seus padrões de resistência e sua correlação
com as mutações associadas à resistência. Os resultados mostraram uma
clara correlação entre a presença de uma mutação e o fenótipo de resistência.
A descrição dos perfis de resistência de estirpes resistentes aos antibacilares
adiciona nova informação para o desenvolvimento de metodologias mais
eficazes para o diagnóstico e tratamento da tuberculose.
De seguida, avaliamos a contribuição dos sistemas de efluxo para o
desenvolvimento da resistência aos antibacilares em
M. tuberculosis
. O estudo
baseou-se na indução
in vitro
de um fenótipo de resistência à isoniazida por
exposição prolongada de estirpes de
M. tuberculosis
à concentração crítica de
isoniazida. Os resultados mostraram que o aumento da actividade de bombas
de efluxo permite a manutenção de uma população resistente num doente em
tratamento, da qual irão emergir mutantes geneticamente resistentes. A
utilização de compostos inibidores de efluxo demonstrou ser capaz de reduzir
este nível de resistência. Por último estudamos o mecanismo de acção dos
compostos inibidores do efluxo, que partilham a característica comum de serem
inibidores de canais iónicos, verapamil, tioridazina, clorpromazina, flupentixol e
haloperidol, quer
in vitro
quer
ex vivo
. Todos os compostos apresentaram
actividade sinérgica inibitória em combinação com os principais antibacilares de
primeira linha e foram capazes de inibir o efluxo activo demonstrando o seu
papel como inibidores de efluxo. Igualmente demostraram potente actividade
bactericida que pôde ser correlacionada com a diminuição nos níveis de ATP
intracelulares. Foi também detectada sobrexpressão de genes de efluxo em
resposta à exposição aos antibióticos
in vitro
e
ex vivo
, indicando que a
resistência aos antibióticos em macrófagos é também mediada pela
sobrexpressão de bombas de efluxo, a qual pode ser inibida por inibidores de
efluxo. Os compostos estudados potenciaram a actividade antimicrobiana de
macrófagos infectados e induziram a acidificação do fagolisosoma, com
consequente expressão de hidrolases lisossomais. Com estes resultados, foi
possível propor, como mecanismo de acção para estes compostos, a inibição
da cadeia respiratória micobacteriana. Esta inibição leva à dissipação do
potencial de membrana, depleção de ATP, a produção de radicais de oxigénio
e morte celular. Por outro lado, e em simultâneo, a disrupção da força motriz
protónica (PMF) resulta na inibição dos sistemas de efluxo que dela dependem,
promovendo assim a retenção dos antibióticos sujeitos a efluxo activo. No que
se refere a célula hospedeira, a acidificação phagosomal estimulada por estes
compostos actua em sinergismo com vários componentes da resposta
imunitária do hospedeiro, restringindo assim o crescimento intracelular de
M.