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A n a i s d o I HM T
Deteção de antigénio recombinante
As nanopartículas funcionalizadas (AuNP-MUA ou AuNP-
-CALNN) foram conjugadas com o anticorpo anti-
Pf
HRP2
numa razão molar de 25 por ligação eletrostática ou covalente
e seguidamente incubadas com diferentes concentrações de
antigénio recombinante
Pf
HRP2.
Da análise dos géis de agarose obtidos com estes bionanocon-
jugados incubados com antigénio, concluiu-se que a deteção
de antigénio recombinante só foi conseguida para os bionano-
conjugados AuNP-anticorpo formados na presença dos agen-
tes de reticulação EDC/NHS, uma vez que estes conferem
uma maior estabilidade aos bionanoconjugados [27]. Nos bio-
nanoconjugados baseados em AuNP-MUA observou-se uma
diminuição da mobilidade eletroforética até cerca de -0,92
µm cm/ V s, que corresponde a uma concentração em an-
tigénio de 12 µg/mL, sendo que a partir desta concentração
ocorreu uma estabilização da mobilidade eletroforética até
concentrações de antigénio de pelo menos 100 µg/mL (Figura
5A). Na presença de bionanoconjugados funcionalizados com
CALNN, observou-se uma diminuição de mobilidade eletro-
forética à medida que a concentração de antigénio aumenta,
até cerca de -1,1 µm cm/V s, correspondendo a 700 µg/mL
de
Pf
HRP2, estabilizando neste valor para concentrações de
antigénio superiores e até cerca de 1000 µg/mL (Figura 5 B).
Observa-se assim, que na presença dos bionanoconjugados
AuNP-CALNN-anti-
Pf
HRP2 é possível detetar concentra-
ções de antigénio recombinante
Pf
HRP2 cerca de uma ordem
de grandeza superior à detetável em presença de bionano-
conjugados AuNP-MUA-anti-
Pf
HRP2. Tal propriedade pode
dever-se ao facto do pentapéptido CALNN promover uma
ligação mais favorável entre o anticorpo e a AuNP, o que por
sua vez pode favorecer a ligação de maiores quantidades de
antigénio
Pf
HRP2 [28,29].
Deteção de antigénio em sobrenadantes de culturas de sangue huma-
no infetado com PfHRP2
As nanopartículas funcionalizadas (AuNP-MUA ou AuNP-
-CALNN) foram conjugadas com o anticorpo anti-
Pf
HRP2
numa razão molar de 25 por ligação covalente e incubadas
com diferentes concentrações de sobrenadante de cultura
de sangue humano infetado com
Pf
HRP2
e de cultura não
infetada.
Os resultados obtidos indicam que não há diferença de mo-
bilidade eletroforética entre as diferentes concentrações de
sobrenadante de culturas de sangue humano infetado ou não
infetado (amostra controlo). Estes resultados podem indicar
que não ocorreu ligação do antigénio existente nas culturas
de sangue ao anticorpo que reveste as nanopartículas funcio-
nalizadas, o que se pode dever a uma baixa concentração do
parasita ou à composição do meio de cultura onde o parasita
se mantém. Este meio de cultura maioritariamente rico em
eritrócitos e albumina de soro de bovino [30], pode ser pre-
judicial à ligação do anticorpo ao antigénio.
Western Blot para deteção
do antigénio recombinante
Pf
HRP2
A análise porWestern Blot foi realizada para confirmar que
o antigénio recombinante
Pf
HRP2 pode ser reconhecido
pelo anticorpo monoclonal anti-
Pf
HRP2 conjugado com as
AuNP funcionalizadas com MUA.
Os resultados obtidos mostraram a presença de uma banda
vermelha a cerca de 50 kDa, correspondente ao reconheci-
mento da proteína
Pf
HRP2 em estudo [24].Verifica-se assim
que o uso de bionanoconjugados AuNP-MUA-anti-
Pf
HRP2
revelou ser um método eficaz para a deteção, uma vez que
a proteína alvo foi detetada diretamente na membrana de
nitrocelulose pelo uso de um anticorpo específico (anti-
-
Pf
HRP2) presente à superfície das AuNP. Este mostrou ser
um método de revelação mais rápido, mais simples e mais
económico, comparativamente com a quimioluminescência,
o método mais comum em Western Blot. Este último re-
quer o uso de um anticorpo secundário, substrato de qui-
mioluminescência, película fotográfica e equipamento de
revelação. As AuNP aqui presentes são facilmente sinteti-
zadas, apresentam um baixo custo, têm uma elevada área
superficial que permite a fácil conjugação com os anticor-
pos e permite uma simples visualização e interpretação dos
resultados através do aparecimento de bandas vermelhas.
Um estudo semelhante foi anteriormente realizado por al-
guns de nós para a identificação de um outro antigénio de
malária (
Pf
Hsp70) [18].
Figura 5
–
Eletroforese em gel de agarose de bionanoconjugados formados
na presença de EDC/NHS com diferentes concentrações de antigénio re-
combinante
Pf
HRP2 (indicadas em cada poço).
(A) Eletroforese em gel de agarose de AuNP-MUA-anti-
P
fHRP2 incubados
com diferentes concentrações de antigénio
Pf
HRP2 e respetiva mobilidade
eletroforética; (B) Electroforese em gel de agarose de AuNP-CALNN-anti-
-
Pf
HRP2 incubados com diferentes concentrações de antigénio
Pf
HRP2 e
respetiva mobilidade eletroforética. Os sinais "+" e "–" indicam a polarida-
de dos elétrodos.