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A n a i s d o I HM T
em alcanotióis, tais como o ácido 11-mercaptoundecanóico
(MUA) ou o pentapéptido Cys-Ala-Leu-Asn-Asn (CALNN),
provaram ser moléculas extremamente eficazes para a funcio-
nalização, uma vez que proporcionam uma interface simples,
flexível, conveniente e promovem uma ligação forte entre os
anticorpos e a superfície da AuNP [1,12,13]. O pentapéptido
CALNN possui um grupo tiol na cadeia lateral do N-terminal
da cisteína (C) que permite formar uma ligação covalente à su-
perfície do ouro; alanina (A) e leucina (L) que possuem cadeias
laterais hidrofóbicas, promovendo a auto-montagem do pépti-
do; e dois resíduos hidrofílicos não- carregados de asparagina
(N) que interagem com o anticorpo [14].
A conjugação entre o anticorpo e aAuNP poderá ocorrer por fi-
siossorção (ligação eletrostática) ou por quimiossorção (ligação
covalente), neste caso recorrendo a reticulação entre o anticor-
po e o ligando de funcionalização superficial dasAuNP.
No presente estudo descrevemos o desenvolvimento de dois
nanoimunoensaios para diagnóstico de malária: (i) baseado em
eletroforese em gel de agarose; e (ii)TDR que recorre à tecno-
logia
lab-on-paper
.
Estes nanoimunoensaios têm como base o uso deAuNP funcio-
nalizadas com MUA ou CALNN e conjugadas com o anticorpo
monoclonal anti-
Pf
HRP2, que reconhece especificamente o an-
tigénio de
P.falciparum
Histidine Rich Protein 2 (
Pf
HRP2).
Eletroforese em Gel de Agarose
A eletroforese em gel de agarose é uma técnica clássica de aná-
lise de biomoléculas, que permite caracterizar nanopartículas
isoladas ou conjugadas com biomoléculas, tais como ácidos
nucleicos, proteínas e anticorpos [15-18].
Os géis de agarose são facilmente preparados, encontram-se
livres de componentes tóxicos (ao contrário dos géis de po-
liacrilamida), e permitem a migração das AuNP e conjugados
em direção ao elétrodo de carga oposta, com diferentes velo-
cidades de migração [15]. As distâncias migradas no final do
tempo de corrida do gel, que se traduzem em mobilidades
eletroforéticas (µ), dependem da relação carga/massa das
partículas. Assim, considerando AuNP com carga superficial
negativa uniforme, as mobilidades eletroforéticas dos respeti-
vos conjugados com anticorpos, estão diretamente relaciona-
das com a massa de anticorpo adsorvido à superfície dasAuNP
[18]. Posteriormente, após a adição de antigénio aos conjuga-
dos AuNP-anticorpo, será possível determinar a quantidade
de antigénio ligado por análise das mobilidades eletroforéti-
cas dos conjugados AuNP-anticorpo-antigénio. Pode assim
construir-se uma reta de calibração que será a base para um
método de deteção de antigénio.
TDR em plataforma
lab-on-paper
O TDR proposto foi impresso numa tira de papel de filtro
Whatman Nº 1 segundo a tecnologia
lab-on-paper
.
Esta tecnologia foi introduzida em 2007 pelo grupo de in-
vestigação de George Whitesides da Universidade de Har-
vard [19], tendo sido otimizada no CENIMAT-i3N, FCT-
-UNL [20]. O papel é um substrato atrativo pois é um mate-
rial resistente, leve, que por ser feito de celulose é compatível
Figura 1
–
Testes de diagnóstico rápido. (A) Constituição e modo de funcionamento de umTDR baseado num ensaio competitivo; (B) Exemplos deTDR
comerciais para deteção de malária em amostras de sangue (consultado em
www.malwest.gr, a 24 de julho de 2015).