Anais 2015 - 3º Congresso Nacional de Medicina Tropical - 1º Congresso Lusófono de doenças transmitidas por vetores

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Teste de diagnóstico rápido (TDR)
No desenvolvimento do TDR foi realizada a otimização da
linha de teste, da linha de controlo e do volume de bionano-
conjugados a serem aplicados.
Para a otimização da linha de teste foram testados volumes
de 2 a 6 µl de antigénio recombinante PfHRP2 num interva-
lo de concentrações de 0,6 mg/mL a 1,5 mg/mL. Na linha
de controlo foram aplicados 2,5 µl de anticorpo secundá-
rio (anti-IgG de ratinho) sem diluição (concentração de 11
mg/mL) e até uma diluição de 1:100 ou 1:200 em presença
de bionanoconjugados AuNP-MUA-anti-PfHRP2 ou AuNP-
-CALNN-anti-PfHRP2 respetivamente. O volume da solu-
ção de bionanoconjugados a 12 nM foi testado entre 30 e
70 µl.
Para que as soluções aplicadas ficassem confinadas às linhas
respetivas, foi necessário levantar as respetivas linhas de en-
saio com o auxílio de um clipe, para que a solução de anti-
génio recombinante a aplicar na linha de teste ou a solução
de anti-IgG de ratinho a aplicar na linha de controlo não
migrasse imediatamente ao longo da tira de papel de filtro.
Após secagem das soluções à temperatura ambiente, o clipe
foi retirado e para a realização do teste adicionou-se então a
solução de bionanoconjugados. Esta migrou por capilaridade
ao longo do papel, tal como pretendido.
Sendo umTDR em formato competitivo, no caso de um tes-
te negativo, o antigénio que reveste a linha de teste liga-se
ao bionanoconjugado AuNP-anticorpo, concentrando a cor
vermelha e formando uma linha visível. No caso de um teste
positivo, o conjugado AuNP-anticorpo apresenta antigénio
ligado (proveniente da amostra de ensaio), pelo que não se
ligará à linha de teste, permanecendo esta incolor. Na linha
de controlo, o anticorpo secundário anti-IgG liga-se ao bio-
nanoconjugado AuNP-anticorpo, formando uma linha ver-
melha, independentemente da presença do antigénio alvo, o
que demonstra o correto funcionamento do teste.
As imagens apresentadas foram adquiridas com uma câmara
fotográfica digital Nikon COOLPIX L16 ou com um iPhone
5 (Apple).
Resultados e discussão
Eletroforese em gel de agarose
Formação de bionanoconjugados com anticorpo
A formação dos bionanoconjugados AuNP-MUA-anti-
-PfHRP2 ou AuNP-CALNN-anti-PfHRP2 e a sua otimização
para a deteção do antigénio foi estudada por eletroforese em
gel de agarose.
As AuNP funcionalizadas foram conjugadas com o anticorpo
monoclonal numa razão molar de 0 a 40 por adsorção dire-
ta (ligação eletrostática) ou por reticulação química usando
EDC/NHS (ligação covalente).
Os resultados obtidos mostraram que em todos os casos es-
tudados ocorreu uma diminuição da mobilidade eletroforé-
tica à medida que uma maior concentração de anticorpo foi
conjugado com as AuNP-MUA ou AuNP-CALNN, até uma
razão molar de cerca de 20 anticorpos por AuNP, a partir
da qual ocorreu uma estabilização do valor da mobilidade
eletroforética.
Comparando os resultados obtidos para bionanoconjugados
AuNP-MUA-anti-PfHRP2 ou AuNP-CALNN-anti-PfHRP2,
observou-se na presença de MUA, um maior arrastamen-
to das bandas de conjugados, relativamente aos conjugados
funcionalizados com CALNN, o que pode ser devido a uma
ligação mais fraca do anticorpo anti-PfHRP2 às AuNP-MUA
comparativamente com as AuNP-CALNN (dados não apre-
sentados).
Os géis de agarose de bionanoconjugados AuNP-CALNN-
-anti-PfHRP2 na presença ou ausência de EDC/NHS são
ilustrados na figura 4.
Os conjugados formados por ligação eletrostática (Figura 4
A) apresentaram uma maior diferença de mobilidade eletro-
forética a partir da razão molar de 5 até à razão molar de
20. Razões molares superiores a 20, mostraram a mesma
distância de migração.
Nos conjugados formados por ligação covalente (Figura 4
B), observou-se uma diminuição de mobilidade eletroforé-
tica a partir da razão molar de 2,5 até à razão molar de 20,
estabilizando a este valor para razões molares superiores.
Também se observou um menor arrastamento das bandas de
conjugados o que permite inferir que na presença dos agen-
tes de reticulação EDC/NHS, são formados bionanoconju-
gados mais compactos e robustos, do que na ausência destes.
A análise destes géis de agarose permite concluir que são
necessárias cerca de 20 moléculas de anticorpo por cada
AuNP funcionalizada em solução, para se formar uma co-
roa compacta de anticorpo em torno da AuNP. Assim, para
garantir a formação de conjugados com revestimento total
com o anticorpo, usou-se uma razão molar de 25 anticorpos
por cada AuNP funcionalizada em solução, aquando do de-
senvolvimento doTDR.
Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose de bionanoconjugados
AuNP-CALNN-anti-PfHRP2. (A) Conjugados formados por ligação
eletrostática; (B) Conjugados formados por ligação razões
molares [anti-PfHRP2]/[AuNP-CALNN] são indicadas em cada poço. Os
sinais "+" e "–" indicam a polaridade dos elétrodos.
Artigo Original