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A n a i s d o I HM T
com as nanopartículas funcionalizadas com MUA, provavel-
mente devido ao facto do pentapéptido CALNN favorecer a
ligação do anticorpo à AuNP e por conseguinte favorecer a
ligação deste ao anticorpo secundário imobilizado na linha
de controlo. Uma maior diluição de anticorpo secundário na
linha de controlo torna-se vantajosa, uma vez que permite o
desenvolvimento de um teste mais económico.
Conclusões
O presente trabalho descreve a possibilidade de deteção do
antigénio recombinante
Pf
HRP2, proveniente do parasita da
malária
Plasmodium falciparum
, usando dois nanoimunoen-
saios diferentes: (i) eletroforese em gel de agarose; e (ii) tes-
te de diagnóstico rápido (TDR) com recurso à tecnologia
lab-on-paper
.
Pelos resultados apresentados é possível concluir que 20 mo-
léculas de anticorpo em solução por cada AuNP funcionali-
zada são suficientes para a formação de bionanoconjugados
estáveis. No entanto, os melhores resultados foram obtidos
para AuNP funcionalizadas com CALNN e conjugadas por
ligação covalente ao anticorpo monoclonal anti-
Pf
HRP2,
o que permite concluir que a funcionalização e o modo de
conjugação (eletrostática ou covalente) controlam a ligação
do anticorpo à nanopartícula, com implicações na formação
de bionanoconjugados mais compactos e robustos.
A eletroforese em gel de agarose permitiu comprovar a for-
mação dos bionanoconjugados e a deteção do antigénio em
estudo. A deteção do antigénio recombinante
Pf
HRP2, re-
correndo a esta metodologia, só foi conseguida em presença
de bionanoconjugados preparados por ligação covalente, de-
vido à sua maior estabilidade em comparação com os prepa-
rados por ligação eletrostática. Foi possível detetar cerca de
12 µg/mL de antigénio em presença de bionanoconjugados
AuNP-MUA-anti-
Pf
HRP2 e 700 µg/mL em presença dos
conjugados AuNP-CALNN-anti-
Pf
HRP2. Conclui-se que
aproximadamente 60 vezes mais antigénio foi detetado com
os bionanoconjugados AuNP-CALNN-anti-
Pf
HRP2, o que
demonstra que o pentapéptido CALNN favorece a ligação
do anticorpo à AuNP, e consequentemente a ligação do an-
tigénio.
Recorrendo a eletroforese em gel de agarose, não foi possível
detetar o antigénio a partir do sobrenadante de culturas de
sangue humano infetado, possivelmente devido à baixa con-
centração do parasita ou à composição do meio de cultura
onde este se encontra, que pode prejudicar a ligação anti-
corpo-antigénio.
Os resultados provenientes da análise porWestern Blot mos-
traram que o antigénio recombinante
Pf
HRP2 foi especifi-
camente reconhecido pelos bionanoconjugados. A utilização
de uma solução de bionanoconjugados mostrou ser um mé-
todo de revelação rápido, sensível e de fácil visualização e
interpretação. Trata-se de um método menos dispendioso e
menos demorado comparativamente com o método de reve-
lação indireto, a quimioluminescência, comum emWestern
Blot.
OTDR proposto tem como superfície de teste uma tira de
papel de filtro desenhada segundo a tecnologia
lab-on-paper
,
em que 60 µl de bionanoconjugados a 12 nM foi conside-
rado ser o volume ideal a aplicar no teste. Estes migraram
por capilaridade e estabeleceram ligação com o antigénio
imobilizado na linha de teste e com o anticorpo secundá-
rio imobilizado na linha de controlo. Uma linha vermelha
que demonstra a presença de
Pf
HRP2 foi visualizada na zona
de teste com a imobilização de 2,5 µl de antigénio recom-
binante a uma concentração de 1,5 mg/mL. O anticorpo
secundário foi detetado na linha de controlo em presença
de uma diluição de anti-IgG de 1:45 ou 1:90 quer se trate
de bionanoconjugados AuNP-MUA-anti-
Pf
HRP2 ou AuNP-
-CALNN-anti-
Pf
HRP2, formados por ligação covalente ou
eletrostática. Uma maior diluição de anticorpo secundário
foi obtida na presença de nanopartículas funcionalizadas com
CALNN, tornando-se uma mais-valia para o desenvolvimen-
to de umTDR de menor custo.
O estudo realizado pode ser considerado como a base para o
desenvolvimento futuro de umTDR usando amostras clíni-
cas, com possibilidade de aplicação em laboratórios clínicos
e em análises de campo nos países em vias de desenvolvi-
mento.
Pretende-se dar continuidade a este estudo, aumentando a
sensibilidade do teste com o uso de nanopartículas de ouro
de maior diâmetro (por exemplo, cerca de 50 nm), uma vez
que estas têm uma intensidade de cor que pode ser até 4
vezes superior à intensidade de cor das AuNP de 13 nm de
diâmetro, aqui estudadas, permitindo assim uma melhoria
na deteção. Com o mesmo objetivo, pretende-se também
projetar um TDR composto por uma zona específica para
a deposição das amostras clínicas. Esta zona será desenhada
anteriormente à zona de deposição dos bionanoconjugados,
para que aquando da aplicação da amostra clínica esta migre,
se ligue aos bionanoconjugados imobilizados, e seguidamen-
te continue a sua migração ao longo da tira de papel de filtro,
passando pela linha de teste e pela linha de controlo.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Mestre Maria Rebelo e ao Professor
Thomas Hänscheid (Instituto de Medicina Molecular) pelas
culturas de sangue infetadas com
Plasmodium falciparum
.
Ao Professor Daniel E. Goldberg (Universidade deWashing-
ton, E.U.A) pelo plasmídeo
Pf
HRP2 amavelmente cedido.
À Fundação para a Ciência e a Tecnologia (Projeto UID/
Multi/04378/2013, UID/CTM/50025/2013 e Bolsa de
Pós-Doutoramento SFRH/BPD/63850/2009 (Inês Go-
mes)), parte do Programa EDCTP2 apoiado pela União Eu-
ropeia e COMPETE (Portugal) pelo apoio financeiro.