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A n a i s d o I HM T
dos durante 16 horas a 4 ºC. Na presença de EDC/NHS,
os conjugados foram incubados durante 2 horas à mesma
temperatura.Após a conjugação, o anticorpo não ligado foi
removido por centrifugação e o sedimento foi ressuspendi-
do numa solução de albumina de soro de bovino (BSA), 10
mg/mL e incubado durante 1 hora no escuro. Desta forma,
são impedidas as ligações não específicas, aquando da liga-
ção do antigénio aos conjugados AuNP-anticorpo.
Após este passo de bloqueio com BSA, os conjugados fo-
ram submetidos a 2 ciclos de centrifugação/lavagem com
tampão fosfato de sódio 5 mM, pH 7,2.
No caso da formação de bionanoconjugados AuNP-anti-
corpo-antigénio, incubaram-se diferentes concentrações
de antigénio recombinante
Pf
HRP2 com a mesma razão
molar de anticorpo, durante 2 horas a 4 ºC. Seguidamente
as amostras foram novamente centrifugadas/lavadas com
tampão fosfato de sódio, 5 mM, pH 7,2.
Produção e purificação do antigénio recombinan-
te
Pf
HRP2
A produção e purificação da proteína foram realizadas se-
gundo o procedimento adaptado de Ndonwi
et al.
[24].
Inicialmente foi inserida a sequência de ADN do
Pf
HRP2
contendo uma cauda de 6 histidinas no vetor pET15b. Este
plasmídeo foi introduzido em
células hospedeiras de
E.coli
BL21/DE3 para expressão da proteína
Pf
HRP2 recombi-
nante. As culturas bacterianas cresceram a 37 ºC durante
16 horas e foram transferidas para 2 L de meio LB, no qual
cresceram a 37 ºC até uma densidade ótica a 600 nm entre
0,75 e 0,9. Neste ponto, foi adicionada uma solução de
IPTG 0,05 mM para promover a sobrexpressão da proteína
e a cultura incubou durante 20 horas a 16 ºC. As culturas
foram centrifugadas e posteriormente lisadas por
French
press
. Após obtenção do lisado bacteriano, purificou-se a
proteína
Pf
HRP2 por cromatografia de afinidade, usando
uma resina de Ni-NTA.
A concentração da proteína foi estimada pelo método do
ácido bicinconínico (BCA) [25] e a sua pureza foi avaliada
por eletroforese em gel de SDS-PAGE.
Eletroforese em gel de agarose
Os bionanoconjugados AuNP-anticorpo preparados como
anteriormente descrito, foram centrifugados (22 000 x g,
10 minutos, a 4 ºC) e o sedimento ressuspendido em 13,5
µl de tampão fosfato de sódio, 5 mM, pH 7,2, e 1,5 µl de
glicerol (99,5%). As amostras foram aplicadas num gel de
agarose a 0,5% em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA), pH
8,5. O gel correu durante 30 a 40 minutos a 150 V num
sistema de eletroforese ENDURO (Labnet).
A mobilidade eletroforética (µ) foi calculada de acordo
com a equação 1, que representa o quociente entre a ve-
locidade de migração das amostras (
ʋ
) e o campo elétrico
aplicado (E) [26].
(equação 1)
Western Blot com deteção pelos conjugados AuNP-
-anticorpo
O ensaio deWestern Blot foi efetuado para se comprovar o re-
conhecimento do antigénio recombinante
Pf
HRP2 pelos conju-
gadosAuNP-anticorpo anti-
Pf
HRP2.
O antigénio recombinante a 1,5 mg/mL foi inicialmente se-
parado por eletroforese em gel de SDS-PAGE a 10%, e segui-
damente transferido para a membrana de nitrocelulose através
do sistema Mini-PROTEANTetra (BIO-RAD).Amembrana de
nitrocelulose foi bloqueada com uma solução de BSA a 10 mg/
mL durante 20 minutos, com agitação lenta.Após este período
a membrana foi incubada com a solução de bionanoconjugados
AuNP-MUA-anti-
Pf
HRP2 durante 2 horas, com agitação lenta
à temperatura ambiente e posteriormente lavada 3 vezes com o
tampão PBST (tampão PBS com 0,05% deTween 20) durante
5 minutos.
Projeção do teste de diagnóstico rápido usando a tec-
nologia
lab-on-paper
O teste foi projetado no programa informático Adobe Illustra-
tor CC. Os testes foram compostos por uma zona de deposição
dos bionanoconjugados, uma linha de teste, uma linha de con-
trolo e uma zona de lavagem. Os testes foram impressos em
papel de filtro (Whatman Cellulose Chromatography Paper
Grade 1) com recurso a uma impressora com tinteiros de cera
(Xerox ColorQube 8570). Seguidamente os testes foram difun-
didos numa placa de aquecimento (Robax) durante 2 minutos a
140 ºC para que ocorresse a difusão vertical da cera pelo papel,
formando-se barreiras hidrofóbicas
que definem os canais hidrofílicos
para a deposição das amostras (Fi-
gura 3).
Figura 3
–
Tira de papel de filtro
Whatman Nº 1 desenhada segundo a
tecnologia
lab-on-paper
para o desen-
volvimento doTDR.
Legenda:
1. Zona de deposição dos bionano-
conjugados
2. Linha de teste
3. Linha de controlo
4. Zona de lavagem