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provavelmente como consequência do decréscimo no uso de profilaxia anti-
P.
jirovecii
com sulfas, após a introdução da terapêutica anti-retrovírica potente
(HAART). Nos 10
loci
de
P. jirovecii
analisados, foram identificados e
caracterizados, um total de 23 polimorfismos, dos quais, quatro (
mt85
,
SOD110
,
SOD215
,
DHFR312
) demonstraram estar relacionados com
parâmetros clínicos da infecção, e, por isso, foram considerados como
relevantes no seguimento da investigação. Verificou-se que um genótipo
específico (
SOD110C
/
SOD215T
) demonstrou estar associado a casos de PPc
com maior severidade, enquanto que outros dois genótipos (
mt85C
/
SOD215C
e
SOD110T
/
SOD215C
) foram associados a casos de PPc com menor
severidade. A análise cruzada das sequências permitiu detectar correlações
estatisticamente significativas entre diversos polimorfismos, sugerindo a
existência de potenciais haplótipos. Observou-se um elevado grau de
recombinação entre os genótipos multilocus (MLGs) de
P. jirovecii
, sendo que,
um dos MLGs (MLG E) se encontrava sobre-representado na população,
sugerindo uma estrutura epidémica, na qual o fenómeno de recombinação
genética é frequente, mas onde ocasionalmente, um clone bem sucedido,
tende, rapidamente, a aumentar a sua frequência originando um clone
epidémico.
A técnica de PCR
multiplex
/SBE foi aplicada com sucesso na identificação de
polimorfismos genéticos de
P. jirovecii
em
pools
de DNA, demonstrando que é
possível uma análise num formato múltiplo, abrangendo um elevado número de
amostras.
A metodologia proposta demonstrou ser uma ferramenta útil na caracterização
do perfil genético de
P. jirovecii
, permitindo a amplificação e caracterização de
diversos fragmentos, de uma forma rápida, implicando redução de custos e de
tempo de operação, e possibilitando, a aplicação em larga escala. A
associação das técnicas de PCR
multiplex
/SBE e de DNA
pooling
por RT-PCR
permitiu determinar a distribuição das frequências relativas dos polimorfismos
de base única (SNPs, do inglês
single nucleotide polymorphims
)
DHFR312
,
mt85
,
SOD215
e
SOD110
em subgrupos de doentes, com diferentes
características clínicas. Esta abordagem, possibilitou a identificação de SNPs
presentes nos diferentes subgrupos, permitindo a classificação de
polimorfismos, aparentemente, não relevantes (ex.
DHFR312
), e, conseguindo
seleccionar outros polimorfismos, potencialmente relacionados com diferentes
parâmetros da infecção (ex.
mt85
,
SOD215
e
SOD110
). Assim, os SNPs
seleccionados podem, de alguma forma, estar associados a haplótipos de
P.
jirovecii
com características distintas, ou seja, potencialmente implicados em
diferentes graus de severidade da doença.
Os resultados obtidos com o presente estudo, permitem colocar a hipótese de
que haplótipos de
P. jirovecii
com características distintas podem existir, e que,
regiões genéticas específicas podem funcionar como marcadores desses
mesmos organismos. A aplicação das metodologias de alto rendimento,
propostas nesta investigação, pode acelerar a identificação de polimorfismos
de
P. jirovecii
relevantes a nível clínico, permitindo uma aproximação baseada
em haplótipos para caracterização clínica deste microrganismo patogénico,
auxiliando e adequando a escolha do tratamento mais indicado, possibilitando
assim, um melhor controlo da doença. A robustez, sensibilidade e
especificidade, demonstradas pelas técnicas de PCR
multiplex
/SBE e de DNA
pooling
, fazem com que sejam indicadas, não só para o estudo de
P. jirovecii
,
mas também para o estudo de inúmeros microrganismos, em especial de
microrganismos não cultiváveis, nos quais, a limitação da amostra, faz com que
sejam requeridas técnicas de alta capacidade, para que seja possível a