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ESTEVES, Francisco de Carvalho (2010) Identificação de múltiplos
marcadores polimórficos em
Pneumocystis Jirovecii
: relação com a
evolução clínica, Dissertação de Doutoramento no ramo de
Ciências Biomédicas, especialidade de Parasitologia. IHMT. Lisboa
Resumo
:
Pneumocystis jirovecii
é um importante agente infeccioso, causador
de pneumonia (PPc) em doentes com infecção vírus da imunodeficiência
humana/síndroma de imunodeficiência adquirida (VIH/sida), tendo sido,
também, já descritos casos de infecção em imunocompetentes ou em doentes
com graus moderados de imunodeficiência. Sequências polimórficas de ácido
desoxirribonucleico (DNA) são detectadas frequentemente em isolados de
P.
jirovecii
, sugerindo que a variação genética é comum neste microrganismo e
que diversos subtipos genéticos podem existir. Permanecem por esclarecer as
razões pelas quais os doentes sofrem de diferentes graus de severidade de
PPc. Alguns estudos apontam para que determinados indicadores do
prognóstico clínico possam estar relacionados com a apresentação e a
evolução da infecção por
P. jirovecii
. Por outro lado, também é sugerido que
polimorfismos específicos possam determinar características epidemiológicas
do microrganismo, como a distribuição geográfica de determinados subtipos, os
modos de transmissão, ou mesmo, fenómenos de resistência a fármacos, ou
diferentes graus de virulência. Coloca-se a hipótese de que a virulência de um
determinado subtipo de
P. jirovecii
possa estar dependente de múltiplos genes
e, portanto, da associação de polimorfismos múltiplos que ocorrem em diversas
regiões do genoma. Com o objectivo de identificar genes potencialmente
associados com factores da infecção por
P. jirovecii
e com o propósito de
desenvolver técnicas moleculares de alto rendimento, efectuou-se o estudo da
variabilidade genética de isolados deste microrganismo, em Portugal. O
trabalho envolveu a recolha de espécimes pulmonares de doentes infectados
por
P. jirovecii
com diferentes características clínicas e integrou as
metodologias de imunofluorescência indirecta com anticorpos monoclonais
(IFI/AcM), reacção de polimerização em cadeia (PCR), sequenciação directa,
análise de fragmentos de restrição (RFLP), PCR
multiplex
, genotipagem por
reacção de polimerização de base única (SBE), PCR em tempo real (RT-PCR)
e DNA
pooling
.
Os genes candidatos considerados no presente estudo, foram seleccionados
com base numa extensa pesquisa bibliográfica: o gene da subunidade grande
do rRNA mitocondrial (
mtLSU rRNA
), o gene do citocromo
b
(
CYB
), o gene da
superóxido dismutase (
SOD
), o gene da _-tubulina (_
TUB
), o gene da
tiorredoxina reductase (
TRR
1), o gene da timidilato sintetase (
TS
), o gene da
dihidrofolato reductase (
DHFR
), o gene da dihidropteroato sintetase (
DHPS
), a
região conservada (
UCS
) dos genes da família das glicoproteínas major de
superfície (
MSG
) e o gene da protease
kexin-like
(
KEX
1). Este procedimento
inicial, permitiu avaliar o interesse relativo destes 10
loci
, verificar a informação
sobre as respectivas sequências, sua variabilidade, importância a nível
metabólico e a potencialidade para estas regiões poderem estar relacionadas
com características da infecção, como resistência a fármacos, ou factores de
virulência.
A diversidade genética, as frequências de distribuição de genótipos e a relação
entre os genótipos observados e diversos parâmetros da infecção, foram
investigadas por PCR seguido de sequenciação directa, ou RFLP. A análise
dos resultados permitiu confirmar o declínio das mutações associadas a
fenómenos de resistência aos fármacos da família das sulfas, em Portugal,