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jirovecii
identificados no período de 2001–2004 (260 isolados) e entre 1995–
2000 (30 isolados), foram submetidos ao estudo de caracterização genética,
nos três
loci
em estudo.
Inicialmente, com o intuito de melhorar a técnica de amplificação do gene da
DHPS de
P. jirovecii
, procedeu-se á filtração das amostras de secreções
pulmonares, para remoção de DNA do hospedeiro contaminante, e foi
elaborado um novo protocolo de amplificação. Apesar, de se ter verificado que
o processo de microfiltração não promovia uma melhor amplificação de DNA
específico de
Pneumocystis
, o protocolo de PCR “nested” desenhado
contribuiu para a maior amplificação do gene da DHPS de
P. jirovecii
(
P
<0,001).
A caracterização genética da DHPS e da DHFR, permitiu identificar o genótipo
selvagem em 84,5% e 68,9%, respectivamente, dos isolados estudados. Em
15,5% dos isolados, observou-se a presença de genótipos mutantes nos
codões 55 e 57 do gene da DHPS. Em relação ao gene da DHFR, 31,1% dos
isolados apresentaram polimorfismos. No total, foram identificados nove locais
de substituição: quatro substituições sinónimas, nas posições nucleotídicas
201, 272, 312 e 381; cinco substituições nucleotídicas não sinónimas nas
posições 38, 68, 92, 154 e 200 que resultaram na alteração nos codões 13, 23,
31, 52 e 67, respectivamente. No estudo efectuado, verificou-se que as
mutações do gene da DHPS, foram mais frequentes entre os isolados obtidos
em 1995-2000 do que entre os isolados recolhidos entre 2001 e 2004
(
P
=0,056). Relativamente ao gene da DHFR e, em contraste com a maioria dos
estudos publicados, observou-se uma elevada diversidade genética entre os
isolados estudados.
Também, nas regiões ITS de
P. jirovecii
, foi observada uma elevada
variabilidade entre os isolados estudados. No presente trabalho, 30 genótipos
diferentes foram identificados, o que evidencia o elevado grau de diversidade
genética destas regiões e a sua utilidade no estudo da transmissão e da
epidemiologia da PPc. No estudo efectuado, os genótipos mais frequentes
foram o Eg, o Cg e o Gg. Verificou-se que o genótipo Ne foi significativamente
mais frequente entre 1995–2000 (
P
= 0,026) enquanto que o genótipo Eg foi
mais frequente entre 2001–2004 (
P
=0,011).
Considerando a combinação dos genótipos identificados nestas três regiões
genómicas, foram observados 50 haplótipos distintos em 100 isolados de
P.
jirovecii
. A elevada diversidade intra-específica observada neste estudo
multilocus demonstra o potencial que esta abordagem pode ter na
diferenciação de tipos
P. jirovecii
distintos e a sua utilidade no estudo da
transmissão e da epidemiologia da PPc. No estudo efectuado, polimorfismos
nos genes da DHPS e da DHFR, presumidamente associados à exposição ao
cotrimoxazol, foram detectados em doentes não expostos a este fármaco. Esta
observação pode sugerir que estas sequências polimórficas possam ser
adquiridos acidentalmente, por transmissão pessoa-a-pessoa ou através de
uma fonte ambiental, e não somente por pressão selectiva do cotrimoxazol.
Também, a identificação de genótipos idênticos, nas três regiões genómicas
em estudo, em diferentes populações de doentes sugere a ocorrência de
transmissão pessoa-a-pessoa. No geral, o presente trabalho contribuiu para a
clarificação do papel das mutações nos genes da DHPS e da DHFR no
possível desenvolvimento de resistência ao cotrimoxazol em
P. jirovecii
assim
como para a melhor compreensão da transmissão e da epidemiologia da PPc.