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A n a i s d o I HM T
rasitas sensíveis e resistentes, calculou-se o coeficiente de
similaridade (S),(
Dice’s
coefficient
) [20, 21] de acordo com
a fórmula:
Onde
a
corresponde ao número de bandas partilhadas por
ambas as estirpes,
b
corresponde ao número de bandas pre-
sentes na estirpe susceptível e ausentes na estirpe resistente
e
c
corresponde ao número de bandas presentes na estirpe
resistente e ausentes na estirpe susceptível.
Todos os procedimentos técnicos foram realizados de acor-
do com a legislação nacional e Europeia (DL 276/2001 e DL
314/2003), no que respeita à protecção e bem-estar animal.
Resultados
Dos 10
primers
utilizados para o
RAPD-PCR
, dois (OPI-
16 e OPI-17) não apresentaram qualquer padrão pas-
sível de comparação, tendo os restantes oito
primers
apresentados padrões de bandas comparáveis. Destes
oito
primers
com padrões de bandas bem definidos, sete
(OPI-3, OPI-5, OPI-6, OPI-8, OPI-9, OPI-12 e OPI-
18) apresentaram diferenças polimórficas. Estes
primers
produziram um total de 54 fragmentos bem definidos (5
a 12 fragmentos, média de 8 fragmentos) entre 200 pb e
1200 pb. Do total de fragmentos gerados 23 foram po-
limórficos (43%), com o
primer
OPI-5 a gerar mais po-
limorfismos, seguido dos
primers
OPI-6 e OPI-9 (Tabela
2). A identificação de bandas polimórficas foi feita com
base na comparação de padrões de bandas no mesmo gel
para ambas as estirpes, sendo apenas consideradas poli-
mórficas as bandas detectadas em todos os indivíduos da
mesma estirpe.
Uma vez observadas as diferenças polimórficas entre pa-
rasitas sensíveis e resistentes, calculou-se o coeficiente
de similaridade (
Dice’s coefficient
) (Tabela 2). O
primer
OPI-5 foi o que obteve um coeficiente de similarida-
de mais baixo (0,25) apenas havendo partilha de uma
banda entre ambas as estirpes e 3 bandas polimórficas
para cada
primer
. O
primer
OPI-7 não apresentou dife-
renças polimórficas entre ambas as estirpes e o
primer
OPI-3, (de entre os
primers
que apresentaram diferenças
polimórficas) foi, dos
primers
que apresentaram poli-
morfismos, o que teve coeficiente de similaridade mais
elevado (0,83), com 5 bandas comuns
para ambas as estirpes e duas bandas
polimórficas apenas presentes na estir-
pe resistente.
5
tensão final a 72ºC durante 10 minutos. A electroforese foi realizada em gel de agarose a
% corado com brometo de etídio (EtBr). Todas as amostras amplificadas com o mesmo
imer
foram incluídas no mesmo gel.
bela 1
–
Lista de
primers
utilizados para
RAPD-PCR
Primer
Sequência
OPI-3
5'- CAGAAGCCCA -
3’
OPI-5
5’ –
TGTTCCACGG -
3’
OPI-6
5’ –
AAGGCGGCAG -
3’
OPI-7
5’ –
CAGCGACAAG -
3’
OPI-8
5’ –
TTTGCCCGGT -
3’
OPI-9
5’ –
TGGAGAGCAG -
3’
OPI-12
5’ –
AGAGGGCACA -
3’
OPI-16
5’ –
TCTCCGCCCT -
3’
OPI-17
5’ –
GGTGGTGATG -
3’
OPI-18
5’ –
TGCCCAGCCT -
3’
a vez observadas as diferenças polimórficas entre parasitas sensíveis e resistentes,
lculou-se o coeficiente de similaridade (S),(
Dice’s
coefficient
) [20, 21] de acordo com a
mula:
de
corresponde ao número de bandas partilhadas por ambas as estirpes,
corresponde
número de bandas presentes na estirpe susceptível e ausentes na estirpe resistente e
c
rresponde ao núme o de bandas presentes n estir e r siste te e aus ntes n estirpe
sceptível.
Tabela 1 -
Lista de
primers
utilizados para RAPD-PCR
Figura 1 -
RAPD-PCR, OPI-5. MW – marcador
molecular 2000 bp; ER 100 - Estirpe resistente a 100
mg/kg de Paziquantel;ES - Estirpe sensível a PZQ;ER
120 - Estirpe resistente a 120 mg/kg de Paziquantel.
M – Macho; F – Fêmea; B – Macho+Fêmea.