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CASACA, Ana Leonor Vidal Gomes (2011) Uma abordagem yeast
two hybrid
para o estudo da replicação e patogénese do vírus da
hepatite delta, Dissertação de Doutoramento no ramo de Ciências
Biomédicas, especialidade de Biologia Celular e Molecular. IHMT.
Lisboa.
Resumo:
O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das
formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões
do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O
HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite
B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite
fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do
invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV
(HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção.
O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples,
circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento
interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral
que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de
editing
do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-
HDAg) e a grande (L-HDAg).
Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a
ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de
RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar
partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes,
admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre
os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável
de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a
importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do
ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o
número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua
replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV
permaneça por identificar.
Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado
humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema
yeast Two-
Hybrid
(YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir
com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram
envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características
funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções
com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas
seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a
embryonic lethal abnormal vision like1
(ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação
a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA,
previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros
vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização
preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs.
As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No
caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de
interacção com a S-HDAg foi confirmada quer
in vitro
por
blot overlay
quer
in
vivo
por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas
células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os
RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas
hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas