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TOMÁS, Ana Luísa Regatão (2014) Novas abordagens no diagnóstico
serológico da pneumocistose. Dissertação de Mestrado em Ciências
Biomédicas, IHMT, Lisboa.
A pneumonia por
Pneumocystis
(PPc) é uma importante infeção respiratória em
doentes imunocomprometidos. O seu diagnóstico é baseado na visualização
microscópica de quistos ou formas tróficas coradas e/ou na deteção de DNA de
Pneumocystis jirovecii
por PCR, em espécimes pulmonares normalmente obtidas
por técnicas invasivas. O desenvolvimento de um teste serológico fiável e
reprodutível é uma necessidade premente, pois permitirá o diagnóstico da PPc com
recurso a amostras obtidas de forma minimamente invasiva, como o sangue.
Este estudo associou a síntese de um antigénio recombinante à técnica de ELISA
(do inglês,
Enzyme-linked immunosorbent assay)
para deteção de anticorpos anti-
P.
jirovecii
, procurando desenvolver uma nova abordagem laboratorial para o
diagnóstico da PPc.
O antigénio recombinante sintético multiepítopo foi selecionado, desenhado e
produzido com base no estudo da imunogenicidade do domínio carboxilo-terminal
da glicoproteína
major
de superfície (MsgC) de
P. jirovecii
. O gene sintético
codificante do antigénio recombinante foi clonado no vetor de expressão pLATE 31,
através da tecnologia de clonagem independente de ligase. Este vetor permitiu a
produção do antigénio recombinante sintético multiepítopo com uma cauda de poli-
histidina terminal, o que permitiu a sua purificação por cromatografia de alta
afinidade com iões níquel imobilizados e a sua utilização como ferramenta
antigénica em uma técnica de ELISA. Esta técnica foi otimizada para a pesquisa de
anticorpos totais e das imunoglobulinas IgG e IgM anti-
P. jirovecii
.
Foram estudados espécimes pulmonares e soros de 80 doentes
imunocomprometidos, com suspeita de patologia pulmonar, e 17 soros de dadores
de sangue (controlo). Os casos de PPc foram confirmados por imunofluorescência
indireta com anticorpos monoclonais e por
nested
PCR. A informação clínica do
diagnóstico presuntivo da PPc (sintomas, PaO2, exames radiológicos) estava
disponível.
Estatisticamente, os níveis de IgM anti-
P. jirovecii
estavam aumentados nos doentes
com PPc (
p =
0,003), o que nos fez rejeitar a hipótese nula de que a distribuição
deste marcador seja idêntica entre doentes com e sem PPc. O teste ELISA com
pesquisa de anticorpos totais e IgG anti-
P. jirovecii
não apresentaram resultados
estatisticamente significativos (
p
> 0,005).
A análise da curva ROC (do inglês,
Receiver Operating Characteristic
) do teste
ELISA com pesquisa de IgM anti-
P. jirovecii
mostrou que o
cut-off
que apresentou
melhores resultados se situava numa absorvância (Abs) de 0,300 a 405 nm, com
uma sensibilidade de 97 % e uma especificidade de 75 % (
p
< 0,001), quando
associado ao diagnóstico clínico para a PPc.
Com esta abordagem inovadora, desenvolveu-se um novo método para deteção de
P. jirovecii
, sensível e específico quando associado ao diagnóstico clínico. Esta
abordagem poderá funcionar como teste de rastreio da PPc, diminuindo a