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estudo três bibliotecas combinatórias de fragmentos de anticorpos recombinantes
(scFv – Griffin1.
,
Tomlinson J
e
I)
e apenas uma biblioteca (
Griffin 1.
) para o
segundo e terceiro estudos.
No primeiro estudo obtiveram-se partículas fágicas monoclonais cuja presença foi
validada com o antigénio MsgC, apresentando sequências com 550 a 750 pb,
tamanho expectável para
scFv
. Na fase de produção de
scFv
em
E. coli HB2151
,
não houve expressão de
scFv
, possivelmente, devido à sequência recombinante
obtida possuir um codão terminal amber TGA em excesso, o que impossibilita a sua
expressão.
Para o segundo e terceiro estudos os resultados foram inconclusivos.
Com base nos resultados obtidos neste estudo, pode-se assumir que apenas com a
utilização de antigénio puro (MsgC recombinante) haverá maior hipótese de se obter
scFv
para poder utilizar no diagnóstico da pneumonia por
Pneumocystis
.
SEQUEIRA, Daniela Filipa Policarpo (2015) Explorar a versatibilidade
das células de insecto para a produção de VLPs do vírus da gripe,
Dissertação de Mestrado em Microbiologia Médica, IHMT, Lisboa.
A co-expressão de várias hemaglutininas (HA) e proteína da matriz (M1), no mesmo
hospedeiro, formando partículas semelhantes a vírus (VLPs), constitui uma
importante estratégia para desenvolver vacinas contra o vírus da gripe. Este
trabalho mostra a combinação de uma linha celular estável de células de insecto
com o sistema de expressão mediada por baculovírus para a produção deste tipo de
VLPs. Foram estabelecidas duas populações de células de insecto Hi5,
expressando duas HAs, posteriormente infectadas com um baculovírus contendo a
proteína M1, a duas concentrações celulares diferentes (CCI; 2 e 3×106 cells/mL)
sendo que a mais elevada demostrou ser a mais produtiva. De seguida,
implementou-se uma estratégia baseada na adição de nutrientes específicos para
prolongar o tempo de cultura. As culturas previamente suplementadas e infectadas
a uma CCI de 4×106 células/mL produziram 4x mais HA comparativamente às
culturas infectadas a uma CCI de 2×106 células/mL, não suplementadas. Esta
estratégia foi também aplicada num biorreactor de 2L permitindo 1,5x mais
produção, volumétrica, de HA comparativamente a experiências em pequena
escala.
De forma a ultrapassar a imprevisibilidade de uma integração aleatória, foi
explorado o sistema de troca de cassete mediado por recombinase (RMCE). A
viabilidade de um sistema com duas cassetes integradas flanqueadas por diferentes
locais de reconhecimento (FRTs) foi avaliada, tendo sido observada a interação
entre ambos os pares selecionados. Como segunda estratégia, foi implementado
um sistema com uma cassete para co-expressão de dois genes em simultâneo, em
células de insecto Sf9. Porém, os clones isolados mostram fraca expressão de M1 e
HA, pelo que uma estratégia de isolamento de clones com expressão génica mais
forte está em desenvolvimento utilizando uma tecnologia de sorteamento.
Assim, este trabalho demonstra a versatilidade da tecnologia aplicada em células de
insecto, que pode ser explorada para produzir VLPs multivalentes, com potencial
para se tornar a próxima geração de vacinas para o vírus da gripe.