55 / 114
55
A n a i s d o I HM T
pelo teste
t
-student quando comparação de apenas 2 grupos ou
ANOVA de factor único para comparação de 3 ou mais grupos
com a hipótese nula de que não existem diferenças significativas
entre os grupos.
Determinação de infecção por B.bigemina
Os níveis de infecção foram determinados por
PCR
quantitativo
do gene 18s rDNA (Genbank AY603402) utilizando os primers
5´-AATAACAATACAGGGCTTTCGTCT-3´ e 5´-AACGCGA-
GGCTGAAATACAACT -3´. A normalização foi feita contra o
gene da carraça 16S rDNA pelo método deltadeltaCT [35, 36].
Os níveis de infecção foram comparados entre carraças alimen-
tadas com sangue infectado suplementado com soro anti rCRT e
carraças alimentadas com sangue infectado e soro controlo atra-
vés do teste
t
- student de variância desigual (P≤ 0.05).
Expressão diferencial do gene CRT
Foram comparados os níveis de expressão do gene CRT entre
grupos utilizando
PCR
em tempo real com transcrição reversa.
Os
primers
utilizados 5´-TGAGAGTCTTGTGGGGAAGG-3´e
5´- CGTCATCCTCCTTCTTGCTC- 3´ amplificam um frag-
mento de 171 pares de bases [18]. O kit utilizado foi o iScript
One-Step RT-PCR Kit w/ SYBR Green (BioRad) no termoci-
clador BioRad IQ5 comas condições finais de 10min a 50ªCpara
transcrição reversa, seguido de 5min a 95ªC para inactivação
da enzima transcriptase seguido de 40 ciclos de 15seg a 95ªC,
30seg a 55ªC e 30seg a 68ªC.Os níveis de mRNA foram norma-
lizados utilizando o gene de referência 16S rRNA (5´-GACA-
AGAAGACCCTA-3´ e 5´-ATCCAACATCGAGGT-3´ previa-
mente descritos por Zivkovic [37]) pelo método deltadelta CT
[35, 36].As diferenças entre grupos foram analisadas pelo teste
t
-student (P≤0.05).
Resultados e Discussão
O gene calreticulina (CRT) foi seleccionado para estudos de
caracterização. A sequência amplificada de cerca de 1250 pb
(figura 1) foi comparada com sequências disponíveis de
R.
annulatus
(AAR29939),
R. microplus
(AGK88372)
R. sangui-
neus
(AY395275),
Ixodes scapularis
(AY690335)
Amblyomma
americanum
(U07708) e
Dermacentor variabilis
(AY241957)
e como esperado foi obtida uma alta similaridade entre as
sequências (Tabela 1).
Deve ser no entanto referido que a sequência utilizada para
comparação possui apenas 1100pb (limitação do método
Fig. 1-
Amplificação do fragmento de interesse por
PCR.
Os resultados
foram analisados por electroforese num gel de agarose a 1%/ 0.5x TBE
com SYBRsafe. Poço 1: marcador de 100pb (Promega); Poço 2: Fragmen-
to amplificado com cerca de 1250pb.
Fig. 2 -
Análise por
Western blotting
da expressão da rCRTx6His utilizando
anticorpo anti-histidina. Poço 1: Marcador de peso molecular, Low Mo-
lecular Weight calibration kit for SDS electrophoresis (GE Healthcare);
Poço 2: Cultura de
E. coli
BL21 transformada não induzida a 37ªC por 1
hora; Poço 3: Indução de proteína a 37ªC por 1hora; Poço 4: Cultura de
E.
coli
BL21 transformada não induzida a 37ªC por 2 horas; Poço 5: Indução
de proteína a 37ªC por 2 horas;
Fig. 3 -
rCRT purificada. Gel SDS-PAGE a 12.5% corado com Coomas-
sie-blue. Poço 1: Marcador de peso molecular, Low MolecularWeight ca-
libration kit for SDS electrophoresis (GE Healthcare); Poço 2 e 3: 1µg de
proteína recombinante purificada.