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Materiais e métodos
O presente estudo foi desenvolvido em concordância com o
guia de uso e manipulação de animais laboratoriais da Uni-
versidade de Querétaro, México.
1.
Expressão e purificação de
calreticulina
recombinante
A sequência codificante correspondente á CRT foi obtida
por
PCR
(
Polymerase chain reaction
). As sequências iniciadoras/
Primers
5´-CACC AT GCG GCT TCT CTG CAT TTT G -3
e 5´- CAG TTC TTC GTG CTT GTG GTC -3` foram de-
senhadas usando como modelo a sequência presente no
Gen-
bank
, AY395253. 200 ng cDNA de
R. annulatus
foram uti-
lizados com o kit de PCR Advantage ® 2 PCR polymerase
mix (Clontech). Os produtos de
PCR
positivos foram puri-
ficados usando o kit illustra GFX™ PCR DNA (GE Heal-
thcare, Buckinghamshire, UK) de acordo com as instruções
fornecidas pelo fabricante e posteriormente sequenciadas pela
StabVida (Almada, Portugal) e analisadas. Para a expressão de
rCRT com cauda poli-histidina foi utilizado o kit de expres-
são ChampionTM pET101 directional TOPO® Expression
Kit (Invitrogen Life Technologies). Sumariamente, a sequên-
cia obtida anteriormente por
PCR
foi inserida no plasmídeo
vector pET101/D-TOPO que depois foi utilizado para trans-
formar células
E. coli
OneShot® cells (Invitrogen LifeTechno-
logies).A correcta inserção da sequência de interesse nos plas-
mídeos foi confirmada por sequenciação e o mesmo vector
foi depois usado para transformar células BL21 Star™ (DE3)
One Shot cells (Invitrogen LifeTechnologies).A expressão de
rCRT foi induzida por IPTG (isopropiltiogalactosídeo) numa
concentração final de 0,5 mM.A cultura celular foi lisada por
sonicação e partir da fracção solúvel dos extractos as proteínas
recombinantes foram purificadas por cromatografia de afini-
dade utilizando uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare). A
pureza da amostra foi determinada por gel de SDS-PAGE e
a concentração da rCTR foi calculada a partir do método de
Bradford usando BSA (
bovine serum albumin
) como padrão.
2.
Produção de anticorpos policlonais
Murganhos BALB/c de 4-6 semanas foram imunizados in-
traperitonealmente com 20µg de rCRT emulsionada com
adjuvante de Freund incompleto (Sigma-Aldrich) em intervalos
de 3 semanas até ser obtido um título de anticorpo satisfatório.
Depois de 4 imunizações foi colhido sangue da cauda de cada
murganho e o título de anticorpo foi determinado por ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay) indirecta. Depois de
mais uma imunização para impulsionar a produção de anticor-
pos o murganho com melhor resposta imunogénica foi sacrifi-
cado por deslocamento cervical e todo sangue foi colhido. Por
centrifugação o soro foi separado dos restantes compostos san-
guíneos. O soro foi posteriormente utilizado emWestern blot-
ting como anticorpo primário para determinação do reconheci-
mento correcto da rCRT bem como nos ensaios de alimentação
artificial. Soro controlo, proveniente de murganhos imunizados
apenas com PBS foi obtido de igual forma.
3.
Alimentação artificial
Sangue bovino não infectado e infectado por Babesia bigemina
Para obter sangue infectado por
B.bigemina
, um vitelo Holstein de
6 meses foi esplenectomizado e 2 semanas mais tarde foi inocu-
lado intravenosamente com 2x10
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B. bigemina
(estirpe Modelet)
crio-preservada. A infecção foi monitorizada pela temperatura
corporal animal, hematócrito e esfregaços de sangue periférico.
5 a 6 dias depois da inoculação 500 ml de sangue bovino foi reco-
lhido da veia jugular. O sangue não infectado foi obtido de igual
forma de um bovino saudável livre de babesiose e anaplasmose.
Obtenção de carraças R.microplus
As carraças
R. microplus
(cepa Media Joya, CENAPA, México)
utilizadas neste estudo foram produzidas na Universidade de
Querétaro, Mexico. Originalmente estas carraças foram reco-
lhidas de gado naturalmente infestado. Um vitelo de raça Hols-
tein de 3 a 4 meses livre de babesiose e anaplasmose foi utilizado
para obter as fêmeas
R. microplus
. O vitelo foi infestado no dia
zero com 0.5 gramas de larvas
R.microplus
e 20 a 21 dias depois
fêmeas adultas parcialmente alimentadas foram retiradas manu-
almente do vitelo.
Alimentação artificial por tubos capilares
As carraças recuperadas foram limpas, pesadas e fixas sobre uma
bandeja de poliestireno (214 x 114 mm) com ajuda de fita-cola
de dupla face. As fêmeas com peso inferior a 20 mg ou supe-
rior a 60 mg foram rejeitadas bem como as fêmeas com danos no
aparelho bucal. Estes ensaios foram realizados em ambiente con-
trolado a temperatura de 26-28ªC e humidade relativa superior
a 85%. Foram formados grupos experimentais de 15 fêmeas e a
alimentação decorreu por 28h do seguinte modo: Grupo alimen-
tado com sangue bovino, grupo alimentado com sangue bovino
suplementado com soro anti-rCRT, grupo alimentado com san-
gue bovino suplementado de soro controlo. O mesmo desenho
experimental foi utilizado para sangue bovino infectado com
B.
bigemina
.Cerca de 10µl de soro foi oferecido a cada carraça.Tubos
capilares de vidro (75 mm x 1,0 x 1.5 mm) sem anticoagulante
foram cheios com a refeição sanguínea e colocados sobre as peças
bucais das carraças estimulando a alimentação. Os tubos capilares
foram reposicionados e substituídos sempre que necessário ou de
3 em 3 horas. Depois da alimentação as fêmeas foram retiradas
das bandejas de poliestireno, pesadas para determinar ingestão de
sangue e colocadas num tubo eppendorf 2 ml furado na tampa e
mantidas numa incubadora a 27ªC e humidade relativa de 85%
para promover digestão de sangue e oviposição.A 5 carraças por
grupo foi permitida a oviposição, tendo sido determinado o peso
dos ovos.As restantes, 2 a 3 dias depois de terminada a alimenta-
ção, foram utilizadas para extracção de DNA e RNA a fim de de-
terminar níveis de infecção e expressão de CRT.As comparações
de incremento de peso bem como de peso de oviposição foram
realizadas primeiro utilizando a ANOVA sendo que a hipótese
nula proposta é que não existem diferenças significativas no incre-
mento de peso ou oviposição dos grupos, seguida de uma análise
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