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estirpe de
E. coli
deficiente em antiporters Na
+
/H
+
, a estirpe
E. coli
KNabc. Os
antiporters Na
+
/H
+
de
N. meningitidis
, foram capazes de conferir resistência ao Na
+
,
a esta estirpe, sugerindo que os dois possam contribuir para a homeostasia do Na
+
e pH. O NmNhaE é também capaz de transportar Li
+
, e parece ser o principal
antiporter Na
+
/H
+
a
contribuir para este papel em
N. meningitidis
. O NmNhaE tem
atividade de antiporter Na
+
/H
+
entre valores de pH 6.5 a 9, e a atividade Na
+
(Li
+
)/H
+
ótima é observada a pH 7. Além disso, verificou-se que o NmNhaE tem maior
afinidade para o Na
+
. Com o objetivo de encontrar resíduos importantes na função e
estrutura do NmNhaE, dez resíduos de aminoácidos foram selecionados apartir de
comparações de alinhamentos entre sequências de aminoácidos, e também através
de estudos anteriores de mutagénese dirigida noutros antiporters Na
+
/H
+
, tendo as
mutações pontuais sido intruzidas no gene
nhaE
, resultando nas mutações E91Q,
H161L, G174S, D182N, H201L, V258T, H272L, H356L, H361L e G413S. Quando a
expressão dos mutantes foi induzida em
E. coli
KNabc, todos os mutantes, com
exceção dos mutantes G174S e H201L, foram capazes de complementar a estirpe
KNabc, permitindo que esta crescesse em meio LBK líquido com NaCl 500 mM.
Este facto sugere que as mutações G174S e H201L podem impedir a atividade de
antiporter Na
+
/H
+
. Nos mutantes E91Q, V258T e H361L o
K
m
determinado a pH 7,
para o Na
+
, é semelhante ao determinado no NhaE selvagem, contudo o seu
V
max
sofreu uma descida de quase duas vezes. Além disso, a atividade medida a pH 7
para os mutantes V258T e E91Q, e a atividade medida a 7.5 para o mutante V258T,
diminuiu relativamente ao NhaE selvagem. Este resultado juntamente com as
atividades medidas a pH 7 e 7.5, sugerem que os resíduos E91, V258, H361
estejam envolvidos na resposta ao pH. No mutante H272L, verificou-se um aumento
no
K
m
determinado para o Na
+
a pH 7 para quase o dobro, enquanto o
V
max
se
manteve inalterado em relação ao NhaE selvagem. Os parâmetros cinéticos e as
atividades medidas a pH 7 e 7.5 sugerem que o resíduo H272 pode estar envolvido
no transporte de Na
+
e também na resposta ao pH. Nos restantes residuos não se
verificou atividade de antiporter Na
+
/H
+
. Este trabalho contribuiu para uma melhor
compreensão do transporte de Na
+
nos antiporters Nha de
N. menigitidis
,
nomeadamente no funcionamento e estrutura do NhaE. No futuro, este trabalho
pode fornecer informação relevante quanto ao papel do Na
+
na infeção e
sobrevivência desta bactéria no hospedeiro.
VIEIRA, Patrícia Manuela da Silva (2012) Caracterização genética de
cryptosporidium spp. em amostras biológicas de humanos e animais
provenientes da Roménia: comparação com as características dos
organismos obtidos das populações humana e animal portuguesa,
Dissertação de Mestrado em ciências biomédicas, IHMT, Lisboa.